سید مصطفی، اولین فرزند حضرت امام خمینی (س)، در 21 آذر 1309 ه. ش (21 رجب 1349 ه . ق) در شهر مقدس قم دیده به جهان گشود. امام خمینی (س) برای زنده نگه داشتن یاد و خاطرۀ پدرشان حاج سید مصطفی که به دست خوانین خمین کشته شده بود، برای خود نام خانوادگی مصطفوی و برای اولین فرزندش نام سید مصطفی را برگزیدند.

وی دوران کودکی را در دامان مادری با تقوا و پدری عالم و فرزانه پشت سر گذاشت. بهره مندی از چنین خانواده ای و رشد و پرورش در چنان محیط مذهبی و آکنده از معنویت، در شکل گیری شخصیت مذهبی، علمی و اسلامی سید مصطفی و شکوفایی استعداد و نبوغ وی در زمانی که جامعه دچار بی سوادی و مسائل و مشکلات فرهنگی و اجتماعی عدیده ای بود، نقش شایانی داشت. سید مصطفی در هفت سالگی به مدرسۀ موحدی قم رفت و تا پایان دورۀ دبستان؛ یعنی ششم ابتدایی در آن مدرسه و مدرسۀ باقریۀ قم تحصیل کرد. سپس در سن پانزده سالگی قدم به عرصۀ طلبگی نهاد و وارد حوزۀ علمیۀ قم شد. وی پس از پایان دوره مقدماتی، بلافاصله وارد مرحله سطح شد و به فراگیری و آموزش فقه و اصول پرداخت. ایشان تحصیل دوره خارج را با حضور در حوزه درس آیت اللّه بروجردی و امام خمینی آغاز کردند و پس از درگذشت آیت اللّه بروجردی در سال 1340، ضمن ادامه درس خارج فقه در محضر پدر دانشمندش، از محضر درس آیت اللّه سید محمد داماد نیز بهره گرفت. او به واسطه نبوغ و استعداد علمی و موفقیت در تمامی مراحل تحصیلات حوزوی، پنج سال پس از ورود به دوره خارج، در 27 سالگی به درجه اجتهاد نایل آمد.
او در سال 1335 در بیست و چهار سالگی با معصومه حائری، دختر آیت اللّه شیخ مرتضی حائری ازدواج کرد که حاصل این ازدواج سه فرزند با نامهای محبوبه، حسین و مریم می باشد.
سید مصطفی در تمامی فعالیتهای سیاسی قبل و بعد از تبعید حضرت امام خمینی (س) و به ویژه در قیام 15 خرداد 1342 نقش به سزایی داشت و سرانجام در این راه در سال 1356 در سن 47 سالگی به درجه رفیع شهادت نایل آمد.